News

Gratias tibi ago pro natura.com adire.Versio navigatoris utens quam subsidia limitata CSS habet.Ad optimam experientiam commendamus ut navigatro renovato uteris (vel inactivare Compatibilitas Modus in Penitus Rimor).Interea, ut subsidia continua conservent, locum sine stylis et JavaScript reddemus.
Propinquitas enzymaticae delineandi modos in esters vel phenoxys radicales excitandis late adhibentur ut proteomatum subcellulares et interdum interactores in cellulis viventium describant.Autem, esters reducuntur minus reactivae sunt, inde in lato radiorum labellae, et phenoxy radicales ex peroxide curationis generatae per vias redox impedire possunt.Hic nuntiamus proximitatem dependens dependens photoactivationis (PDPL) methodum evolutam genetice ligandi dapibus miniSOG photosensitizer ad dapibus usuris.Lumen caeruleum Urguet et tempore expositionis moderatur, oxygeni singlet generatur et tunc spatiotemporaliter resoluto labella ex histidine residua per anilineum specillum efficitur.Eius altam fidelitatem per organelle-specialis proteome destinata demonstramus.Comparatio PDPL cum TurboID ex parte laterali ostendit subtiliorem et comprehensivam coverage proteomicae PDPL.Deinde PDPL applicavimus coactivatorem BRD4 et E3 Parkin ligasis transcriptionis morbo associatum et interactores antea ignotos repperimus.Per overexpressionis protegendi, duo subiecta ignota, Ssu72 et SNW1, Parkin notae sunt, quorum degradatio mediatur per iter ubiquitination-proteasome.
Accurata characterizationis retiacula dapibus multis fundamentalibus processibus cellularibus subest.Ideo, valde accurate spatiotemporales destinata interactiones interationes praebebit hypotheticum fundamentum ad biologicas vias, morbos pathologiam explicandas, et has interationes ad medicinas fines dissipandas.Ad hunc finem, modi sunt valde optabiles modi detegendi interationes temporales in vivis cellis vel texturis.Affinitas Purificationis Massae Spectrometriae (AP-MS) historice adhibita est ad cognoscendos socios ligandos servo usuris (POIs).Cum evolutione quantitatis proteomicorum methodorum Bioplex3.0 creata est, maxima datorum dapibus reticulorum AP-MS fundata.Etsi AP-MS valde potens est, lysis cellae et gressus dilutionis in workflui se praebent ad debiles et transientes interationes ligandas et artificia post lysin introducunt sicut paria commercia spuria quae compartmentalization carent ante lysin.
Ad has quaestiones compellare amino acida innaturalia (UAA) cum coetibus transversis et enzymaticis vicinis tabulationibus (PL) suggestis (eg APEX et BioID) ortae sunt.Etsi methodus UAA in multis missionibus feliciter applicata est et informationes praebet de dapibus adhesivis directis, optimizatio de situ insertionis UAA adhuc requiritur.Potius, est methodus labelandi stoichiometrica quae catalytica conversionis eventuum labellarum caret.E contra, methodi enzymaticae PL, quales sunt methodi BioID, fuse ad POI7 ligase biotin machinatum, quae postea biotin efficit ut biotinyl-AMP ester medium reactivum efficiat.Enzyme sic catalyzat et emittit motum biotin "nubis" quod residua lysina proximalis pittacia.Nihilominus, BioID plus quam 12 horas requirit ut signum sufficiens intitulatum obtineat, quod usum cum resolutione temporali praecludit.Usus evolutionis directae in ostentatione fermenti fundata, TurboID designatus est in BioID magis efficax, permittens labellum efficientis cum biotin intra 10 minutas, permittens processibus dynamicis investigandis.Quia TurboID gradus biotin valde activos et endogenosos satis sunt ad pittacium low-gradum, color pittacii fit quaestio potentialis, cum labellatio valde aucta et intempestiva per additionem biotini exogenosi requiritur.Praeterea esters reducuntur male reciproci (t1/2 ~5 min), qui ad magnum radium pittacium ducere possunt, praesertim post satietatem proximarum servo cum biotino 5. Alio accessu, fusione genetica peroxidasis ascorbati machinatorum (i.e. biotin-. phenol radicalia dapibus et interdum labella in uno minuto concedit 9. APEX late adhibetur proteomatum subcellulare, membrana interdum complexa, et dapibus cytosolicis significatio complexus 11, 12. Necessitas tamen peroxidum concentrationes altos vel semitas redox servo vel meatus afficere potest. processus cellularum.
Sic nova methodus capax suppressionis specierum intitulatum-radii reactivum generare cum accuratione locali et temporali sine signanter disrumpentibus meatus cellulosis, magni momenti erit accessio ad methodos exsistentes. Inter species reactivas, oxygeni simplices attentionem nostram excitaverunt propter brevem vitam et limitatam diffusionem radii (t1/2 < 0.6 µs in cellis)13. Inter species reactivas, oxygeni simplices attentionem nostram excitaverunt propter brevem vitam et limitatam diffusionem radii (t1/2 < 0.6 µs in cellis)13. Среди активных форм наше внимание привлек синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках)13. Inter formas activas, dolor singlet attendit attentionem propter brevem vitam et limitatam diffusionem radiorum (t1/2 <0.6 µs in cellis)13.t1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13。 1/2 < 0.6 µs）而引起了我们的注意13 Среди активных форм наше внимание привлекает синглетный кислород из-за его короткого времени жизни и ограниченного радиуса диффузии (t1/2 < 0,6 мкс в клетках). Inter formas activas, dolor singlet attrahit attentionem propter brevem vitam et limitatam diffusionem radii (t1/2 < 0.6 μs in cellis).Singletum oxygenium passim relatum est ad oxidizandum methioninum, tyrosinum, histidinem et tryptophanum, faciens illud polarium 14,15 ad affectum amine vel thiol fundatum probes16,17.Etsi oxygeni singlet adhibitus est ad cellulas subcellulares RNA, strategies pro repurando endogenosa POI figuli propinquitas inexplorata manent.Hic exhibemus suggestum appellatum photoactivation-dependens propinquitatem labellae (PDPL), qua luce caerulea utimur ad illustrandum POIs fusum cum miniSOG photosensitizer et trigger generationi singlet oxygeni ad residuas proximales oxidizandas, quae sequuntur modificationes aminei continentes ut chemicae explorationes oxidizent. medium cellulae vivae..Nos coetus chemicorum explorationum ad augendum tag proprietatem et modificationem identificandam sites utentes proteomicis apertis workflus temptavimus.Comparatio PDPL cum TurboID ex parte laterali ostendit subtiliorem et comprehensivam coverage proteomicae PDPL.Hunc accessum ad notas subcellularis proteome et generalis proteomas identitatis ligaturae applicavimus ad dapibus BRD4 cancro-associatis epigeneticis regulatoriis et Morbosi Parkinson-consociati E3 ligasis Parkin, quae tam notam et ignotam retis dapibus confirmaverunt. interationes..Facultas PDPL cognoscendi E3 subiecta in magnis complexibus interdum dapibus repraesentat condicionem in qua requiritur obligatorum indirectorum cognitio.Duo ignoti parkin subiecti mediante ubiquitination-proteasome in situ confirmati sunt.
Lorem photodynamica (PDT) 19 et inactivatio laseris inactivatio chromophoreum adiuvata (CALI) 20, in qua lux irradiatio cum photosensitizeribus oxygenium singlet gignit, scopum movere potest servo vel causam cellae mortis.Cum oxygenium singletum sit substantia valde reactiva cum diffusione theoretica distantia circiter 70 um, spatio oxidationis circum photoensitizer limitata temperari potest.Secundum hanc notionem, simplicibus oxygenio uti decrevimus ad articulationem complexionum dapibus in vivis cellulis assequendas.Accessum chemoproteomicum PDPL elaboravimus ad quattuor functiones implendas: (1) ad catalysandam generationem activae singlet oxygenii similes accessibus PL enzymaticis;(2) tempus determinatum in luce initiationis tinguere;(3) per alterationem (4) Cofactores endogenosos (ut biotin) utendo utendo ad curriculum reducendum, vel reagentes exogenosos (qualia peroxides) valde perturbant ut cellam nuditatem ad accentus environmental extenuent.
Photosensitizers in duo genera inter parvas hypotheticas pondus fluorophores dividi possunt (exempli gratia bengal rosa, methylene caeruleum) 22 et genesim encoded scutellas parvas (eg miniSOG, KillerRed)23.Ad consilium modulandum assequendum, primam generationem PDPL suggestum elaboravimus, additis servo photosensitizer (PS) ad POI24,25 (Figura 1a).Cum luce caeruleo irradiata, oxygenium oxidizet residua proximalis nucleophilici amino acidorum, inde in umpolung polaritas quae electrophilica est et ulterius agere potest cum amine specillo nucleophilo 16,17.Specillum designatur cum manubrio alkyno ad chemiam click permittendam et detrahendam characterem LC/MS/MS.
Schematica illustratio de pterygia complexorum interdum a miniSOG mediante.Cum luci caeruleo expositae sunt, cellulae miniSOG-POI exprimentes oxygenium singletum generant, quod inter se commercium servo sed non ligandi servo mutat.Intermedia producta photooxidationis intercipiuntur a pitta- tis cinematicis aminei chemicis ad adductos covalentes formandos.Circulus alkynyl de chemia explorans permittit cliccum chemiam ad locupletationem per viverra-down sequitur quantitatis LC-MS/MS.b Chemical structura ab amine rimatur 1-4.c Repraesentativae analysi fluorescentis gel mitochondrialis localis miniSOG mediatae proteomicae utentes rimatur 1-4 et quantitas relativa secundum densitometriam gel.Signum-ad-background ratio proborum chemicorum aestimata est experimentis temperantiae negativis exclusis lumine caeruleo vel HEK293T cellulis sine expressione miniSOG adhibitis.n = 2 exemplaria biologica independens.Singula puncta imaginem biologicam repraesentat.d Deprehensio Repraesentativa et quantitatis PDPL utendi optimized speci 3 in praesentia vel absentia partium indicatarum PDPL sicut c.n = 3 exemplaria biologica independens.Singula puncta imaginem biologicam repraesentat.Centrelines et whiskers medium ac ± excessus vexillum repraesentant.CBB: Coomassie Brilliant Blue.e Confocal imaginatio oxygeni singlet cum macula Si-DMA longe rubra.Scala bar: 10 µm.Gel imaginatio et experimenta confocali independenter repetita sunt saltem bis cum similibus eventibus.
Primum probavimus facultatem miniSOG26 et KillerRed23 perfectorum photosensitariorum, in HEK293T stabiliter expressis, ad mediationem propargylaminam de proteoma chemicis probandi (supplementary Fig. 1a).Analysis gel fluorescens ostendit totum proteome labellum in miniSOG et caeruleo irradiationis lumine consecutum esse, cum nullum productum labelingum visibile apud KillerRed observatum sit.Ut signum-ad-background rationemque meliorem redderemus, tunc certa explorationum chemicarum quae aniline (1 et 3), propylamine (2), vel benzylamine tentavimus, probavimus.Animadvertimus ipsas HEK293T cellulas habere insignem background altiorem nulla luce caeruleo comparatum, fortasse ob endogenous riboflavin photosensitizer, flavin mononucleotide (FMN) 27 . Aniline-substructio chemicae explorationes 1 et 3 meliores notas reddebant, cum HEK293T miniSOG in mitochondria stabiliter exprimens >8 triplicem augmentum in signo probandi 3, dum probe 2 usus est in RNA-labentis modo CAP-seq tantum ostentans ~2.5- ovile signum auctum, verisimile ob diversas optiones reactivitatis inter RNA et interdum (fig. 1b, c). Aniline-substructio chemicae explorationes 1 et 3 meliores notas reddebant, cum HEK293T miniSOG in mitochondria stabiliter exprimens >8 triplicem augmentum in signo probandi 3, dum probe 2 usus est in RNA-labentis modo CAP-seq tantum ostentans ~2.5- ovile signum auctum, verisimile ob diversas optiones reactivitatis inter RNA et interdum (fig. 1b, c).Aniline-substructio chemicae explorationes 1 et 3 melius specificitatem ostendit: HEK293T, quae stabiliter miniSOG in mitochondria exprimit, plus ostendit quam 8 triplicem augmentum in signo probandi 3, dum probe 2, in CAP-seq RNA methodo labella adhibita, solum ~ 2.5 duplici signo aucti, probabiliter ob varias optiones reactivitatis inter RNA et interdum (fig. 1b, c).1 3 HEK293T miniSOG，探针3 > 8 RNA CAP-seq 2 ~ 2.5-倍信号增加，可能是由于RNA 1b，c）。1 3 hek293t 3 rna 2 2 2 2 -倍信号增加，可能是由于RNAAniline-substructio chemicae speculatoria 1 et 3 melius specificitatem habuit, HEK293T miniSOG in mitochondria stabiliter expressit, et probans 3 plus quam 8 triplicem augmentum in signo habuit, dum 2 pro CAP-seq RNA methodum pittacii tantum ~2.5 -duplici incrementi ostendit.in signo, probabiliter ob diversas optiones reactiones inter RNA et interdum (Fig. 1b, c).Praeterea probandi 3 isomers et hydrazinae speculatoriae (probationes 5, 6, 7) probatae sunt, 3 optimizationem probandi confirmantes (Supplementary Fig. 1b,c).Similiter in-gel fluorescens analysis alios parametri experimentales optimized ostendit: irradiatio necem (460 um), specillum chemicum concentratio (1 mM), et tempus irradiatio (20 min) (Fig. 2a-c).Quaelibet pars vel gradus omissis in PDPL protocollo consecuta est in insigni conversionis in curriculo (fig. 1d).Egregie, interdum pittacium signanter imminutum erat coram sodium vel troloxum, quod notum est ad restinguendum oxygenium singlet.Praesentia D2O, quae notum est oxygenium ad stabiliendum singlet, signum pterygia auget.Ad conlationem aliarum speciei oxygenii reactivae ad pterygia, mannitolum et vitaminum C investigandum additae sunt ut scavengers radicalis hydroxyli et superoxidei, respective 18, 29, sed non inventae sunt ad pittacium minuendum.Additio H2O2, sed non illuminatio, non valuit in pter pter (Supplmentarium Fig. 3a).Fluorescens imaginatio oxygenii singlet cum specula Si-DMA confirmavit praesentiam oxygenii simplicis in filum HEK293T-miniSOG, non autem in filo originali HEK293T.Praeterea mitoSOX Rubrum productionem superoxidam post illuminationem deprehendere non potuit (Fig. 1e et Fig. 3b Accessiones) 30. Haec notitia valde suadet ut oxygeni singlet principales species oxygenii reactivas responsabiles proteomic subsequentes labeling.Cytotoxicitas PDPL aestimata est inter lumen irradiationis et chemicae speculatoriae caeruleae, et nulla notabilis cytotoxicitas observata est (Supplem. Fig. 4a).
Ut investigare mechanismum pteris et proteomic identificatio complexionum interdum utentium LC-MS/MS perspiciamus, primum opus est determinare quae amino acida modificantur et della massa pittacii explorandi.Methionina, histidine, tryptophan et tyrosina nuntiata sunt ab oxygenio singlet 14. 15. mutari.Integumentum TOP-ABPP31 laboris fluxum cum aperta inquisitione pensata, a FragPipe computandi suggestum in MSFragger32 fundatum, integramus.Post modificationem oxygeni singlet ac chemicum specillum delineandi, preme chymia facta est usus reductionis biotini pittacium continens nexus fissilis, sequitur neutravidin extensio et digestio trypsin.Peptida mutatio, resinae adhuc alligata, photofixa est pro analysi LC-MS/MS (Figura 2a et Data Accessiones 1).Magna pars modificationum in toto proteome cum super 50 peptide map (PSM) factae compositus (fig. 2b).Mire, solum modificationem histidinis observavimus, probabiliter ob altiorem reactivitatem histidinis oxidizati versus anilineos quam alia amino acida.Secundum mechanismum histidinis oxidationis editum per singlet oxygenii, 21,33 structuram delta-massa propositam +229 Da respondet adducto 3 probandi cum 2-oxo-histidine post duas oxidationes, cum +247 Da productum hydrolysis est. of +229 Da (Supplementary Fig. 5).Aestimatio spectri MS2 ostendit altam fidem identitatis plurium y et b ionum, incluso identificatio fragmentorum mutationum (y et b) (Fig. 2c).Analysis contextus localis seriei histidinum PDPL mutatarum motivum moderatum praeferentiae pro parvis residuarum hydrophobicarum in ±1 positionibus patefecit (supplementum Fig. 4b).Mediocris, 1.4 histidines per interdum identificabantur, et situs horum figentium solvendo accessibilis superficiei (SASA) et relativae disponibilitate solvendo (RSA) analysi (Supplementary Fig. 4c,d).
Incorruptus workflow ad studium residua selectivity utens suggestu FragPipe computandi a MSFragger.Vinculae syntheses in chemia strepita adhibitae sunt ut photocleavagium peptidum mutationis ex resina streptavidin permitteret.Inquisitio aperta ad cognoscendas modificationes numerosas necnon reliquias pertinentes deducta est.b Tribue missam modificationum per proteome occurrentium.Peptide destinata PSM.c MS2 annotationem spectralis histidinis situs probe mutato 3. Exemplum repraesentativum, reactionem covalentem cum specillo 3 addito +229.0938 Da ad amino acido mutato.d Mutatio tentandi usus est in PDPL indicum examinis.PRDX3 (H155A, H225A) et PRDX1 (H10A, H81A, H169A) translati sunt cum plasmidis silvestribus pro anti-Vexillo detecto.e Synthetica peptide portavit miniSOG purificato coram specillo 3 et productis respondentibus cum m +247 et +229 in spectro LC-MS notatis.f In vitro interdum-ad-interationes interdum cum miniSOG-6xHis-tag et anti-6xHis anticorpi expressas.Antibiotin (streptavidin-HRP) et anti-mus Occidentis dele analysin miniSOG-6xHis/anti-6xHis complexorum anticorporum cum specillo 3 intitulato, pro tempore expositionis in lucem.Labes pro singulis proteinis exprimuntur in pondere hypothetico respondente: LC catena levis, HC anticorpus gravis catena.Haec experimenta independenter iterabantur saltem bis cum similibus eventibus.
Pro biochemical verificationis situs pittacii, PRDX3 et PRDX1, spectrometriae massae notae, ab histidine in alaninum mutati sunt et speciei silvestri in transfection pertentationum comparati.Proventus PDPL monstravit mutationem signanter in labellum reductum (Fig. 2d).Interim sequentia peptida, quae in inquisitione aperta indagatae sunt et in vitro miniSOG purgatae portaverunt coram specillo 3 et caeruleo lumine, producta cedentes cum massa transpositio +247 et +229 Daa detecta a LC-MS (Fig. 2. 2e).).Ad probandum num interactio proximalis servo in vitro in responsione ad miniSOG photoactivationem describi posset, proximitatem artificiosam instituimus tentare per commercium inter interdum miniSOG-6xHis et anti-His monoclonal anticorpus in vitro (Figura 2f).In hoc incepto expectavimus proximalem pittacium anticorporis gravibus et levibus catenis cum miniSOG.Revera, anti-mus (regnoscens graves et leves catenas anti-6xHis-intitulatas anticorporis) et streptavidin Occidentis deletionem ostendebat biotinylationem gravem et levium catenarum validam.Egregie animadvertimus miniSOG autobiotinylationem propter 6xHis tag et transversis nexus inter levia et graves catenas, quae referri possunt ad interstitium superius descriptum inter responsionem proximalem inter lysinam et 2-oxo-histidinem.In fine, concluditur PDPL modificare histidinem in modo propinquitatis dependens.
Proximum propositum erat notare proteoma subcellulare ad probandum proprietatem in situ labellae.Ergo miniSOG stabiliter expressimus in nucleo, matrice mitochondriali, seu membrana exteriore cellularum ER HEK293T (fig. 3a).Analysis gel fluorescens copiosissima nexibus intitulatis in tribus locis subcellulares ac varia exemplaria labella revelata (fig. 3b).Fluorescens imaginatio analysin ostendit altam specificitatem PDPL (Fig. 3c).PDPL laboris fluxum secutae sunt strepita reactiones cum rhodamine tinctorum ad proteomas subcellulares utentes microscopiae fluorescentiae delineare, et PDPL signa colocalata sunt cum DAPI, mitochondriali trackers, vel ER trackers, altam fidelitatem PDPL confirmans.In tribus locis organelles, comparatio PDPL cum TurboID cum TurboID utens avidin Occidentis labem, ostendit PDPL intitulatum specialius comparatum ad suas potestates esse.Sub PDPL conditiones, vincula plura intitulata apparuerunt, magis PDPL intitulatum servo (supplementum Fig. 6a-d).
Schematica repraesentatio miniSOG mediatae organelle-specialis proteome labelingum.miniSOG petant matricem mitochondrialem per fusionem ad N-terminalem 23 amino acida COX4 (mito-miniSOG), nucleus per fusionem ad H2B (nucleus-miniSOG), et Sec61β per lateris cytoplasmici membranae ER ( ER-miniSOG. ).Indicationes includunt imaginatio gel, imaginatio confocal, et spectrometriae massae.b Repraesentativas imagines gel trium perfilarum organelle specialium PDPL.CBB Coomassie Brilliant Blue.c Repraesentativas confocal imagines HEK293T cellularum miniSOG stabiliter exprimentium cum diversis localizationibus subcellulares ab anticorpore intitulatis V5 detectis (rubris).Inscriptiones subcellulares pro mitochondria et ER (viridis).In PDPL workflow inclusa detectionem miniSOG (flavam) intitulatum proteomatum subcellularium utens cy3-azide chemiae click comprehendit.Scala bar: 10 µm.d Insidiae volcanicae de PDPL-tagged proteomatum in variis organellis quantitatis distentae (n = 3 experimentis biologicis independentibus).Duo cercopitheci studentis probatio in vulcano machinata adhibita est.HEK293T genus silvestre adhibitum est ut imperium negativum. Insigniter mutatae proteins illustrantur in colore rubro (p < 0.05 et >2 duplex ion intensio differentiae). Insigniter mutatae proteins illustrantur in colore rubro (p < 0.05 et >2 duplex ion intensio differentiae). начительно измененные елки выделены красным ветом (p< 0,05 и>2-кратная разница в интенсивности ионов). Servaturae insigniter mutatae illustrantur in rubore (p < 0.05 et >2-triplex differentia in ion intensio).p < 0.05 > 2p < 0.05和> 2 начительно измененные елки выделены красным ветом (p< 0,05 и> 2-кратная разница в ионной силе). Servorum notabiliter mutatae illustrantur in rubris (p < 0.05 et > 2 duplici differentia in vi ionica).Remedia servo magni momenti pro HEK293T-miniSOG sed non momenti pro HEK293T in viridi monstrantur.e Analysis speciei proteomicorum datastarum ab experimentis d.Numerus peraeque notabilis servo in unoquoque organello (doctis rubris et viridibus) in summo designatus est.Histograms monstrat proteins locales in organellis innixus MitoCarta 3.0, GO analysis et A. Ting et al.populo.Datasets separatae pro mitochondria, nuclei, et ER.Haec experimenta independenter iterabantur saltem bis cum similibus eventibus.Rudis notitia in forma lima notitia rudis sunt.
Cohortatus ad eventum gel et imaginatio, quantitas pittacii libera adhibita est ad quantitare proteoma identificatum in unoquoque organello (supplementaria data 2).HEK293T intransfecta adhibita est ut negativa potestas ad detrahendum figmentum background. Volcano analysin insidiarum significanter auctam intensionem (p <0.05 et >2-ion intensionem triplicem ostendit) ac servolum singleton qui solum in lineis expressis miniSOG (fig. 3d punctis rubris et viridibus adsunt). Volcano analysin insidiarum significanter auctam intensionem (p <0.05 et >2-ion intensionem triplicem ostendit) ac servolum singleton qui solum in lineis expressis miniSOG (fig. 3d punctis rubris et viridibus adsunt). Анализ графика вулкана показал значительно обогащенные белки (p <0, 05 и > 2-кратная интенсивность ионов), а также одиночные белки, которые присутствуют только в линиях, экспрессирующих miniSOG (рис. 3d, красные и зеленые точки). Volcano analysin insidiarum notabiliter locupletatis proteins (p<0.05 et >Ionum triplicem intensionem ostendit) ac singulae servo, quae tantum in lineis expressis miniSOG (fig. 3d, punctis rubris et viridibus adsunt).p < 0.05 >2 miniSOG 3dp <0.05 > 2 3d Анализ графика вулкана выявил значительно обогащенные белки (p <0, 05 и> 2x ионная сила), а также отдельные белки, присутствующие только в экспрессионной линии miniSOG (красные и зеленые точки на рис. 3d). Volcano analysi machinatio manifestavit dapibus insigniter auctis (p<0.05 et >2x viribus ionicis) ac singulae servo tantum praesentes in linea expressionis miniSOG (punctis rubris et viridibus in Fig. 3d).Coniungentes haec notitia, 1364, 461, et 911 peraeque significantes nuclei, mitochondriales, et ER membranam exteriorem proteins, respective.Ad subtilitatem organelle-locatam PDPL resolvendam, MitoCarta 3.0, gene Ontologia (GO) analysi, et A. Ting et al.data set8 adhibita pro mitochondria, nucleo, et ER ad explorandum organelle specificationem servo deprehensis, subtilitati 73.4, 78.5, et 73.0% respondente (Fig. 3e).Proprietas PDPL confirmat PDPL instrumentum optimum esse ad proteomas specificas organelle distinguendas.Egregie analysis submitochondrialis identitatis servo mitochondrialis ostendit captium proteoma maxime distributum esse in matrice et interiore membrana (226 et 106, respective), rationem 91.7% (362) totius numeri identitatis servo mitochondriali.altam gradum PDPL insuper confirmavit (Supplementary Fig. 7a).Similiter analysis subnuclearis ostendit captum proteome maxime in nucleum, nucleoplasmum et nucleolum distributum esse (Supplementary Fig. 7b).Analysis nuclearis proteomica cum signo localizationis nuclei peptidis (3xNLS) similis accuratio constructio H2B (Supplmentaria Fig. 7c-h).Ad specificationem PDPL titulum determinandam, laminin nuclei A electa est ut laqueo discrete locales POI7.PDPL identified 36 servo insigniter locupletati, quarum 12 proteins (30.0% inter lamin A) bene notae erant lamin A interacting proteins a String database annotatum, cum cento superiore quam methodus BioID (122 proteins) 28 of 28. , 22.9 %) 7. Methodus noster pauciores servo identificatur, fortasse ob areas labellas limitatas, quae per singulas oxygenii magis activos factas est.GO Analysis ostendit identificari proteins maxime in nucleoplasmo (26), membrana nucleari (10), membrana nucleari (9), et nuclei poros nuclei locatos esse (5).Collective, hae servo-locatales nuclei pro 80% ditatorum servo deputati, ulteriorem specificitatem PDPL demonstrant (supplementum Fig. 8a-d).
Cum facultatem PDPL perficiendi propinquitatis notati in organelles constituissent, tum probavimus num PDPL ad analysim POI ligandi socii adhiberi possent.Praesertim PDPL analysis de servo cytosolicorum definire voluimus, quae scuta difficiliora censentur quam versos membrana-locatos ob naturam valde dynamicam.Bromodomain et dapibus extraterminales BRD4 attentionem nostram attraxit ad partes praecipuas in variis morbis 35, 36 .Complexus a BRD4 formatus est coactivator transcriptionalis et scopum therapeuticum magni ponderis.A moderando expressionem factorum c-myc et Wnt5a transcriptionis, BRD4 censetur clavis determinans myeloidalis leukemia (AML), multiplex myeloma, lymphoma Burkitt, cancer colon et morborum inflammatoriorum 37, 38.Praeterea virus aliquod BRD4 oppugnant ad transcriptionem viralem et cellulosam ordinandam, ut papillomavirus, HIV, et SARS-CoV-236,39.
Ad commercium BRD4 describendum utens PDPL, miniSOG coniungimus cum brevi N- vel C-terminali isoformi BRD4.Proventus Proteomic ostendit eminentiam aliudquam inter utrumque constructum (Fig. 9 a).Proteome nuclearis idem cum miniSOG-H2B operit 77.6% servo mutuo cum BRD4 (Supplementary Fig. 9b).Diversis deinde temporibus illuminationum (2, 5, 10, 20 min) adhibitae sunt radii titulum accommodare (fig. 4a et data additamenta 3).Concludimus in brevioribus photoperiodis, PDPL principaliter principaliter label socios obligare directos, dum longiora tempora includunt proteins quae in brevioribus periodis photoactivationis et scuta indirecta in complexionibus pter.Re vera inter puncta temporis adjacentia fortes invenimus (84.6% pro 2 et 5 min; 87.7% pro 5 et 10 min; 98.7% pro 10 et 20 min) (Fig. 4b et Accessiones Fig. 9c).In omnibus coetibus experimentalibus non solum BRD4 sui labellum invenimus, sed scuta notissima ut MED1, CHD8, BICRA, NIPBL, SMC1A, et HMGB1 in chordis datorum annotata.Horum scutorum fortitudo ionica proportionalis est temporis expositioni (Fig. 4c et accessiones Fig. 9d).GO analysis de proteins qui in 2-minutis globus notatur ostendit identificari proteins in nucleo locatos esse et in chromatin retexere et in functione RNA polymerasi implicari.Munus hypotheticum interdum in chromatin obligandi vel transcriptionali coactivationis locupletatum fuit, functioni BRD4 consistente (Fig. 4d).Nervum database-enabled interdum analysis commercium cum BRD4 et HDAC complexuum familiarum inter BRD4 et HDAC primum planum commercium interactentium complexorum inter se gerentium, sicut SIN3A, NCOR2, BCOR, et SAP130 (Fig. 4e et Accessiones Fig. 9e, ostendit), cum BRD4 et HDAC cohaerens histonis acetylatis ligans ..Praeterea scuta repraesentativa, quae LC-MS/MS, inclusa Sin3A, NSUN2, Fus, SFPQ notantur, deletis occidentalibus confirmata sunt (fig. 4f).Nuper relatum est breve isoformia BRD4 formare nucleos cum proprietatibus liquido-liquidentibus phase (LLPS).RNA ligamen proteins et SFPQ LLPS variarum processuum cellularum mediavit et hic notatus est ut sine BRD4 nexibus ligandis notatus.Commercio inter BRD4 et SFPQ confirmata est experimentis co-immunis (co-IP) (Figura 4g), aliam mechanismum suggerens pro periodo liquido-mediato BRD4 separatio ulteriore investigatione digna.Simul sumpti, hi eventus suggerunt PDPL esse optimum suggestum ad cognoscendas notas BRD4 mutuas et ignotas ligaturas servo.
a Schematica repraesentatio miniSOG mediatae BRD4 propinquitatis notati, detectio temporum: 2, 5, 10, et 20 min.b Overlap of proteins, identified with different illustrations times.Dapibus locupletatio, quae in HEK293T-miniSOG-BRD4 notata erat, peraeque signanter comparatur cum typo agresti HEK293T.c Ion intensio cum repraesentativum repraesentativum distentae quantitatis ligaturae BRD4 cognitae per tempus determinatum detectionis.n = 3 exemplaria biologica independens.Data sistuntur ut vexillum declinationis medium ±.d Analysis ontologica Gene (GO) servorum quae in 2-minutis globus notantur.vocabula prima decem GO inscripta sunt.Bullae colorantur secundum categoriam GO terminorum, et bullae magnitudo proportionalis est numero servo in unoquoque termino invento.e Fila analysis of proteins mutuo cum BRD4.Circuli flavi directi gluten et circuli grisei sunt prima tabula glutinis indirecti.Lineae rubrae per experimentum determinatae interactiones repraesentant et lineae caeruleae praedictas interationes significant.f Repraesentativas BRD4 scuta ligantia quae in LC-MS/MS verificabantur per deletionem occidentalem sunt.g Experimenta Co-immunopraecipitationis confirmant commercium inter SFPQ et BRD4.Haec experimenta independenter iterabantur saltem bis cum similibus eventibus.Rudis notitia in forma lima notitia rudis sunt.
Praeter scopos POI consociatos sine identitate, hypothesizamus PDPL aptam esse ad substratos enzymes cognoscendos, quae indoles indirectae ligaturae in magnis complexionibus requirebat ad substratos sine scriptos annotatos.Parkin (encoded a PARK2) est ligasis E3 et mutationes in parkin nota causare morbum autosomal recessivi juvenili Parkinson (AR-JP)42.Praeterea parkin descripta est essentialis mitophagiae (autophagiae mitochondrialis) et amotio speciei oxygeni reacivae.Tamen, etsi plures subiectae parkin notatae sunt, munus parkin in hoc morbo lateat.Ut annotarent sua notata subiecta, PDPL probatum est addendo miniSOG ad N- vel C-terminum parkin.Cellulae tractatae sunt cum cyanide carbonylo protono vectore m-chlorophenylhydrazone (CCCP) ad parkin excitandi per viam PINK1-Parkin.Comparatus cum eventibus nostris BRD4 PDPL, parkin N-terminus fusione ampliorem clypei servom patefecit, quamvis ampliorem portionem C-termini (177 e 210) obtegeret (Figura 5a, b et Data Accessiones 4).eventus consentaneum est cum tradit N-terminalibus tags aberranter movere posse Parkin44.Mire, tantum XVIII imbricatis servo in notitia nostra cum eventibus AP-MS editis pro Parkin43 erant, verisimile ob differentias inter lineas cellas et proteomicos operantium.Praeter quattuor notas servo (ARDM1, HSPA8, PSMD14, et PSMC3) duobus modis notatis (fig. 5c)43.Ad ulteriores convalidandum eventus LC-MS/MS, PDPL curationis et posterioris occidentalis deletionis adhibiti sunt comparare proventus HEK293T cellae parentis tentationis et lineae parkin N-terminalis stabilis.Antea incognita scuta CDK2, DUT, CTBP1, et PSMC4 probata sunt nota ligans, DNAJB1 (fig. 5d).
Volcano machinatio servo-parcini in HEK293T cellulis stabiliter expressis miniSOG ad N- vel C-terminum parkin (n = 3 experimentis biologicis independentibus) expressis.Duo cercopitheci studentis probatio in vulcano machinata adhibita est.HEK293T adhibita est potestas negativa. Insigniter mutatae proteins illustrantur in colore rubro (p < 0.05 et >2 duplex ion intensio differentiae). Insigniter mutatae proteins illustrantur in colore rubro (p < 0.05 et >2 duplex ion intensio differentiae). начительно измененные елки выделены красным ветом (p< 0,05 и>2-кратная разница в интенсивности ионов). Servaturae insigniter mutatae illustrantur in rubore (p < 0.05 et >2-triplex differentia in ion intensio).p < 0.05 > 2p < 0.05和> 2 начительно измененные елки выделены красным ветом (p< 0,05 и> 2-кратная разница в ионной силе). Servorum notabiliter mutatae illustrantur in rubris (p < 0.05 et > 2 duplici differentia in vi ionica).Remedia servo magni momenti pro HEK293T-miniSOG sed non momenti pro HEK293T in viridi monstrantur.b Venn diagramma exhibens servo imbricatis inter N-terminalibus et C-terminalibus constructis imbricatis.N-terminalis tags potest aberranter activate parkin et provenire in servo magis cognoscibili.c Venn diagramma exhibens servo imbricatis inter PDPL et AP-MS.Interactores noti recensentur, inter octo quaterniones cursorum imbricatorum et 11 159 ex proteinis quae in PDPL notantur.d Scuta Repraesentativa quae LC-MS/MS a deletione Occidentali comprobata sunt.e Ssu72 et SNW1 notus est ut INCENSUS parkin subiecta.Hae interdum plasmides FLAG-Tagged in HEK293T et HEK293T-Parkin miniSOG transmissi sunt sequebantur per curationem CCCP variis temporis punctis.Degradatio magis pronuntiata in linea Parkin overexpressionis.f Usus proteasome inhibitor MG132, confirmatum est processum degradationis Ssu72 et SNW1 mediari per proteasome-ubiquitinationem.Haec experimenta independenter iterabantur saltem bis cum similibus eventibus.Rudis notitia in forma lima notitia rudis sunt.
Egregie servo, qui PDPL notificatus est, includere debet servo parkin-vinciendi et eorum subiecta.Ad detectionem parcum substratorum sine numero, septem scutorum notarum (PUF60, PSPC1, UCHL3, PPP1R8, CACYBP, Ssu72 et SNW1) detexit et plasmidas transversas ad has genas normales HEK293T patefaciendas ac stabiliter exprimendas miniSOG-Parkini HEK293T sequitur curationem CCCP.Gradus Ssu72 et SNW1 servorum significanter in miniSOG-Parkin linea stabili redacti sunt (fig. 5e).Curatio cum CCCP per 12 horas consecuta est in insignium deiectione utriusque subiecti.Ad investigandum num degradatio Ssu72 et SNW1 per proteasome-ubiquitinationem regatur, proteasome inhibitor MG132 addita est ad inhibendam actionem proteasome et re vera degradationem eorum processum inhibitum invenimus (Fig. 5f).Scuta non-subiecta additae confirmata sunt ut Parkin interactores utentes deletionem occidentalem (supplementarium Fig. 10), qui congruentes proventus ostendit cum LC-MS/MS.In fine, integratio PDPL laboris fluxionis cum verificationis transmissionis interdum clypeo permittit identificatio ligamenti substrati E3 indistincti.
Communem propinquitatem signandi suggestum elaboravimus qui te permittit cognoscere in spatio ac tempore mutuo POIs.suggestum ex interdum miniSOG photosensitizer fundatum est, quod tantum circiter 12 kDa, minus quam dimidium magnitudinis enzyme maturi APEX2 (27 kDa) et tertiae magnitudinis TurboID (35 kDa).Minor amplitudo applicationum ampliare debet ad parvas interdum interactomes investigandi.Praeterea exploratio additamentorum photosensitentium, sive servo genere enodata sive molecularum parvarum, opus est ut quantum cedat oxygeni simplicis et augendi sensus accessus.Pro emendatione miniSOG, alta resolutio temporalis effici potest utens illuminatione caerulea ad accessionem figentium activate.Praeterea tempus longioris expositionis ampliorem "nubem" oxygenii singlet emisit, inde in modificatione residuorum histidinerum distalinarum, radii labellae auctus, et facultas bene-cantae resolutionis PDPL spatialis.Etiam septem explorationes chemicae probavimus ad rationem accessionis signo-ad-groundi augendam et mechanismum hypotheticum post hunc accessum exploravimus.TOP-ABPP operis fluxus cum incorrupto apertione inquisitionis coniunctus confirmavit modificationes tantum in histidinis factas et nullae microenvironticae constantes ob auctas modificationes histidines observari, nisi modice anteponendi histidinis in regione ansa.
PDPL etiam proteomatum subcellulares designare adhibitum est cum specificitate et coverage proteomatum saltem comparandum cum aliis proximitate labellis et methodis chemicis organelle specificatis.Propinquitas figunt etiam feliciter usi sunt ad designandam superficiem, lysosomalem et secreto-associatam proteomes 46,47.Cum his organellis subcellulares credimus PDPL compatibilia.Praeterea provocavimus PDPL, eligendo scuta pro dapibus cytosolicis ligandis, quae magis implicatae sunt quam membrana ligaturae, servo ob suas dynamicas proprietates et implicationem in plurium interactionum temporalium.PDPL applicatum est duobus proteinis, coactivatori transcriptionali BRD4 et morbo ligamento associato E3 Parkin.Hi duo ministri electi sunt non solum ad suas functiones biologicas fundamentales, sed etiam ad eorum momentum clinicum et potentialem therapeuticam.Pro his duobus POIs, notis devinciendis sociis, ac scutis sine incognitis notae sunt.Egregie phase SFPQ separatio dapibus sociata ab co-IP confirmata est, quae novum mechanismum significare potest quo BRD4 (brevis isoformis) LLPS moderatur.Eodem tempore credimus identificationem Parkin subiectam esse missionem in qua identificatio adhaesiva indirecta requiritur.Duobus hortis unidentificatis substratis et degradationem eorum confirmavimus per iter ubiquitinationis-proteasome.Nuper, mechanismus-substructio captandi belli effecta est ad hydrolasium subiectorum deprehendendas enzymes captandas.Quamquam haec methodus validissima est, non convenit analysi subiectorum, quae in magnorum complexorum formatione implicantur, et covalentium vinculorum inter enzyme et subiectorum formationem requirit.Exspectamus PDPL extendi posse ad studium aliorum interdum complexorum et familiae enzyme, sicut familiae deubiquitinases et metalloproteas.
Nova forma miniSOG, SOPP3 appellata, cum productione simplicia oxygenii aucta est.miniSOG cum SOPP3 comparavimus et meliori notatione perficiendi invenimus, quamvis ratio signo-ad-vocis immutata permansit (Supplem. Fig. 11).Nos hypothesavimus optimam illam de SOPP3 (exempli gratia per evolutionem directam) ad servolum photosensitatorem efficaciores efficere quae brevioribus temporibus exigunt et sic processus cellulosos capiendos dynamicos permittunt.Egregie current versio PDPL ad cellularum ambitum contrahitur, sicut lumen caeruleum postulat illuminationem et fibras profundas penetrare non potest.Haec pluma obstet usum in studiis animalis exemplar.Sed coniunctio optogeneticorum cum PDPL occasionem praebere potuit investigationis animalis, praesertim in cerebro.Praeter alios photosensitizers machinatores ultrarubri hanc limitationem etiam removent.Investigatio in hac provincia currently comparata est.
Linea cellula HEK293T ab ATCC consecuta est (CRL-3216).Cellula linea negativa pro mycoplasma infectio probata et in DMEM (Thermo, #C11995500BT) suppleta est cum 10% foetus bovinum serum (FBS, Vistech, #SE100-B) et 1% penicillinum/streptomycin (Hyclone, #SV30010).crevit in.
3-Aminophenylene (sample 3) et (4-ethynylphenyl) methanamine (sample 4) empti sunt a Bidepharm.Propylamine emptus est ab Energy-chemicis.N-(2-Aminophenyl) inclusus 4-ynamide (probe 1) secundum modos editorum summatim perstringitur.
Accessiones Tabulae 1 constructiones geneticae in hoc studio adhibitae recenset.Sequentiae miniSOG et KillerRed ex plasmido dono P. Zou (Peking University) arctae sunt.Matrix mitochondrialis series targeting e 23 N-terminalibus amino COX4 acida derivata et in vectoribus indicatis adhibitis in conventu Gibson (Beyotime, #D7010S) derivatum est.Ad oppugnandum membranam et nucleum reticuli endoplasmici, SEC61B hominum DNA (NM_006808.3) (NEB, #M0491L) ampliatum per PCR ex cDNA bibliothecae cellae HEK293T, et H2B DNA (a D. Lin, Shenzhen Bay Laboratorium donatum) et cloned ut supra.Nisi aliter indicatum est, aliae interdum genes ad translationem et constructionem cellularum stabilium adhibitae erant PCR ex bibliotheca HEK293T cellae cDNA auctae.G3S (GGGS) et G4S (GGGGS) usi sunt ut ligatores inter esca dapibus et miniSOG.A V5 epitope tag (GKPIPNPLLGLDST) his constructis fusione addita est.Ad expressionem in mammalibus et ad lineam cellulam stabiliendam, constructio miniSOG fusionis subcloned in vector lentiviralis pLX304 fuit.Nam expressio bacterial miniSOG in pET21a vector 6xHis in C-terminus designata erat.
HEK293T cellulae ad 2.0 x 105 cellulae per bene in lamellis sex bene transfunctatae 24 horis postea cum plasmidis lentiviralibus recombinantibus (2.4 μg pLX304) et plasmidum viralium fasciculorum (1.5 μg psPAX2 et 1.2 μg pMD2.G) adhibitis Lipo8000 (Beyotime , #C0533), circiter 80% fusione.Post pernoctare trans- fectionem, medium mutatum est et incubatum per alias 24 horas.Collectio virus peractum est post 24, 48 et 72 horas.Ante infectio scopum cellae linearum, medium virale per 0.8 µm colum (Merck, #millex-GP) et polybrenum (Solarbio, #H8761) addita est ad collationem 8 μg/ml.Post 24 horas, cellulae mediae mutato concessum est recuperare.Cellulae selectae sunt utentes 5 μg/ml blasticidin (Solarbio, #3513-03-9) in tribus primis locis tamquam lectio durior strictioris.Tum 20 µg/ml durior victus ratio est, tribus proximis locis.
Cellae in 12-valvis cubiculis seminatae sunt (Ibidi, #81201) ad densitatem circiter 20000 cellularum per puteum.Ad adhaesionem cellae HEK293T emendandam, adde 50 µg/ml fibronectin (Corning, #356008) dilutum in salina phosphate buffered (PBS, Sangon, #B640435) ad 37°C.Exhedrae pretratae sunt horae 1 et tunc cum PBS removentur.Post 24 h, cellulae cum PBS semel ablutae sunt, incubatis 1 mM probe 3 in solutione recenti Hanks' sal librata (HBSS, Gibco, #14025092) pro 1 h ad 37°C, et tunc incubata caeruleo LED (460 um. ).) radiata pro 10 min ad locus temperatus.Deinde cellae bis cum PBS ablutae sunt et cum 4% formaldehyde in PBS (Sangon, #E672002), pro 15 minutis ad cella temperie fixa.Excessus formaldehyde remotus est a cellulis fixis ter lavando cum PBS.Cellae tunc cum 0,5% Triton X-100 (Sangon, #A600198) in PBS permeabantur et 3 vicibus PBS lavabantur.Tunc conclave remove et singulis specimen 25 µl pressionis reactionis pressionis continentis 50 µM Cy3-azide (Aladdin, #C196720), 2 mM CuSO4 (Sangon, #A603008), 1 mM BTTAA (Confluore, #BDJ-4 ) et 0.5 mg/ml sodium ascorbatum (Aladdin, no. S105024) et incubatis per 30 minuta ad cella temperiei.Post reactionem frangendam, cellulae sex vicibus cum PBS continentibus 0.05% Inter-20 (Sangon, #A600560) (PBST) saeptae sunt ac deinde 5% BSA (Abcone, #B24726) in PBST per 30 minuta ad cella temperie.
Ad colocalizationem immunem, cellulae incubabant primis elementis secundum conditiones indicatas: mus anti-V5 tag mAb (1:500, CST, #80076), lepus anti-Hsp60 mAb (1:1000), ABclonal, #A0564); lepus polyclonalis anti-calnexin anticorpi (1:500, Abcam, #ab22595) vel lepus anti-lamin A/C anticorpus monoclonal (1:500; CST, #2032) in 4 °C cod.Post III tempora cum lavacro PBST, cellae incubatae sunt cum elementis secundis: hircus anti- lepus Alexa Fluor 488 (Thermo, #A11034) dilutus 1: 1000, hircus anti-mus Alexa Fluor 594 (CST, #8889) dilutus 1:1000.Dilutire ad locus temperatus pro XXX minutes.Cellae tunc 3 vicibus cum PBST abluebantur et cum DAPI (Thermo, #D1306) in PBS lavabantur per 10 minuta ad cella temperie.Post 3 lavat cum PBS, cellulae in glycerolo L% (Sangon, #A600232) signatae sunt in PBS pro imaginatione.Imagines immunofluorescentes consecutae sunt utens ZEISS LSM 900 Airyscan2 microscopii confocali et programmatis ZNE 3.5 .
Nam imaginatio fluorescentium oxygenii singlet, cellulae bis cum Hanks HEPES ablutae sunt quiddam priusquam 100 nM Si-DMA in HANKS HEPES quiddam adderet (DOJINDO, #MT05).Exposita luce, cellae incubatoris CO2 incubatae sunt 37°C per 45 minuta.Cellae ergo bis ablutae sunt cum Hanks' HEPES quiddam et cum Hoechst in Hanks' HEPES quiddam ob 10 minutas in cella temperie et subjicitur utens microscopio confocali ZEISS LSM 900., #M36008) in HBSS quiddam continens calcium et magnesium.Post exposita lucem vel doxorubicin (MCE, #HY-15142A), cellae incubatae sunt in CO2 incubatore 37° C. per 10 minuta, bis lota cum quiddam HBSS, et incubata cum Hoechst in HBSS quiddam in cella temperie.minutae.Doxorubicin adhibita est pro specillo positivo ubi cellulae tractatae sunt cum 20 μM doxorubicin in HBSS continentibus 1% BSA pro 30 min.Imagines immunofluorescentes consecutae sunt utens Zeiss LSM 900 microscopii confocali.
HEK293T cellulae mito-miniSOG stabiliter exprimentes ad densitatem circiter 30% in 15 cm acetabula seminata sunt.Post 48 horas, cum ~80% ad confluentiam perventum est, cellae semel cum PBS ablutae sunt, incubatis 1 mM Probe 3 in recenti HBSS quiddam in hora 1 ad 37°C ac dein caeruleo ducta per 10 minuta ad cubiculum illuminata. tortor..Deinceps cellulae PBS bis ablutae sunt, derasae et resuspensae in glacie frigido PBS quiddam continens EDTA liberum protease inhibitores (MCE, #HY-K0011).Cellae lysed ab apice sonicantes pro 1 minuto (secundo in 1 et 1 secundo ad 35% amplitudinis).Mixtio inde centrifuga ad 15,871 xg pro 10 min in 4°C ad obstantiam tollendam, et supernatans intentio ad 4 mg/mL adhibita BCA dapibus primordium ornamentum (Beyotime, #P0009).Misce 1 ml superioris lysate cum 0.1 mM photodegradabili biotin azide (Confluore, #BBBD-14), 1 mM TCEP (Sangon, #A600974), 0.1 mM TBTA ligandi (Aladdin, #T162437), et 1 mM CuSO4 incubator cum fundo. gyrationis usque ad 1 horae locus temperatus.Post reactionem frangendam, solutionem praemixtam mixturam adde (MeOH:CHCl3:H2O = 4 ml:1 ml:3 ml) in phialam vitream 10 ml.Exempla mixta et centrifuga 4500 g pro 10 minutis ad cella temperie.Solutiones inferiores et superiores abiectae, praecipitatae bis cum 1 ml methanoli lavabantur et centrifugerunt 15871×g pro 5 min in 4°C.Adde 1 ml of 8 M urea (Aladdin, no. U111902) in 25 mM ammonium bicarbonatum (ABC, Aladdin, no. A110539) ad praecipitatum dissolvendum.Exemplaria cum 10 mM dithiothreitolo (Sangon, #A100281 in 25 mM ABC) restituta sunt pro 40 minuta ad 55°C, adiecta 15 mM recentia iodoacetamidei (Sangon, #A600539) ad cella temperatura in tenebris.Alkylation intra XXX minuta..Additum 5 mM dithiothreitolum ad obturandum motum addita est.Praepara circiter 100 µl globos NeutrAvidin agarosos (Thermo, #29202) pro singulis specimen lavandis 3 vicibus cum 1 ml PBS.Solutio praedicta proteoma cum 5 ml PBS diluta est et incubata cum globulis NeutrAvidin agarosis pre-latis per 4 horas ad cella temperiei.Grana tunc lavabantur 3 vicibus cum 5 ml PBS continens 0.2% SDS (Sangon, #A600485), 3 vicibus cum 5 ml PBS continens 1M ureas, et 3 vicibus cum 5 ml ddH2O.Grana tunc centrifugatione decerpta et resuspensa in 200 μl 25 mM ABC continentur 1 M urea, 1 mM CaCl 2 (Macklin, #C805228) et 20 ng/µl trypsin (Promega, #V5280).Trypsinize pernoctare in 37°C cum rotatione.Reactio cessavit addito acido formic (Thermo, # A117-50) usque ad pH 2-3 perventum est.Grana lota 3 vicibus cum 1 ml PBS continentis 0.2% SDS, 3 vicibus cum 1 ml PBS continentis 1 M ureae, et tunc 3 vicibus cum 1 ml aquae destillatae.Peptides modificatae lysis levibus dimissae sunt pro 90 min utentes 200 μl 70% MeOH.Post centrifugam supernatantem coactum est.Grana tunc semel cum 100 μl 70% MeOH abluta sunt et supernatantes fundunt.Exemplaria in vacuo Speedvac concentrato exsiccata sunt et ad -20°C condita usque ad analysim.
Ad noscendas et quantitare oxygeni simplices peptidas modificatas, exempla in acido formic 0.1% resoluta sunt et 1 μg peptidum enucleata sunt spectrometri massae Orbitrapae Fusion Lumos Tribrid instructae cum fonte nano ESI ab Tune et Xcalibur a programmate venditoris 4.3.Exemplaria separata sunt in a 75 µm × 15 cm interne referta columna capillaribus cum materia 3 µm C18 (ReproSil-pur, #r13.b9.) et cum facili nLC 1200 UHPLC systematis connexae.Peptides lineares 95 minutissimas chromatographiae gradientis separatae ab 8% solvendo B ad L% solvendo B (A = 0,1% acidum formic in aqua, B = 0.1% acidum formic in 80% acetonitrile), dein lineare ad 98% B min. in 6 min ad valorem fluxum 300 nl/min.Orbitrap eget Lumos notitias colligit alternatim inter plenam MS scan et MS2 scan secundum data.Putris voltage ad 2.1 kV apposita est et temperatura onerariis ioninis capillaris erat 320°C.MS spectra (350-2000 m/z) collecta sunt cum resolutione 120,000, AGC 4 105, et maximum initus tempus 150 ms.Praecursores frequentissimi multiplicati 10 frequentissimi praecursores in unoquoque scan pleno redacti sunt utens HCD cum impulsu normali energiae 30%, fenestrae solitudo quadrupoli 1.6 m/z, et resolutio occasus 30,000.Scopum AGC ad spectrometriam tandem massam utens 5×104 et maximum initus temporis 150 ms.Exceptio dynamica est 30 secundis. Iones vel illae cum onere 1+ et >7+ reiecti sunt pro MS/MS. Iones vel illae cum onere 1+ et >7+ reiecti sunt pro MS/MS. еназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Iones vel iones cum onere 1+ et >7+ reiecti sunt pro MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ >7+ MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ >7+ MS/MS。 еуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Non specificatae iones vel iones cum criminibus 1+ et >7+ reiecti sunt pro MS/MS.
Rudis data est processus usura FragPipe computandi suggestum secundum MSFragger.Missae biases et amino acida respondentes adhibita algorithmo aperto quaesiti praecursoris massae tolerantiae -150 ad 500 Da.Peptides mutatae tunc notae sunt histidinis modificationibus utentes cum massa lucri +229.0964 et +247.1069 Da in PD (Proteome Inventor 2.5, Thermo).
Cellae stabiliter exprimentes gene miniSOG fusum patellae in 6 cm patellis erant.Cum ad 80% confluentiam pervenisset, cellae semel cum HBSS (Gibco, #14025092) ablutae sunt, deinde in HBSS horae 1 37°C cum speciminibus chemicis incubatis et luce caerulea illustratae sunt.10W DUXERIT pro XX minutis ad locus temperatus.Uter species oxygenii reactivas involvat vitaminum C (MCE, #HY-B0166), 5 mM Trolox (MCE, #HY-101445), D2O (Sigma, #7789-20-0), 100 mM mannitolum (Energy Chemical, #69-65-8), 100 μM H2O2, 10 mM NaN3 cellulis supplementis additae sunt.Lotis frigidis PBS, cellae derasae sunt, in tubis centrifugii 1.5 ml collectae, et cum apice sonicatae pro 1 min in 200 µl PBS cum 1x protease inhibitoris sine EDTA (1 s et 1 s extrinsecus, amplitudine 35%).Mixtio inde centrifuga est ad 15,871 × g pro 10 min in 4 °C et supernatantem concentratio ad 1 mg/mL adhibita dapibus primordium ornamentum BCA accommodatum est.Proxime 50 µl superioris lysatae cum azide 0.1 mM rhodamine incubabatur (Aladdin, no. T131368), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligandi, et 1 mM CuSO4 pro 1 hora ad cella temperiei cum rotatione ab imo ad summum.Post reactionem strepita, praecipitatio cum acetona facta est, addita 250 μl acetonis praecellentis ad specimina, incubans -20°C pro 20 min et centrifugiens in 6010×g pro 10 min ad 4°C.Colligunt globulo et coque in 50 µl quiddam 1x Laemmli pro 10 min sub 95 °C.Exempla tunc in SDS-PAGE analytica longa resolvuntur et subjiciuntur utentes Bio-rad ChemiDoc MP Tange systema imaginandi cum programmate Lab Touch Imaginis.
Expressio et purificatio dapibus miniSOG-6xHis recombinantis sicut ante dictum est fiebat.Breviter, E. coli BL21(DE3) cellulae (TransGen, #CD701-02) transformatae sunt cum pET21a-miniSOG-6xHis et interdum expressio inducta cum 0.5 mM IPTG (Sangon, #A600168).Post lysin cellulam, servo ni-NTA agaroso globuli usus mundati (MCE, n. 70666), dialytici contra PBS, et ad -80°C repositi sunt.
Anticorpus in vitro pittacii innixus propinquitas detentat, 100 μM miniSOG, 1 mM probe 3, et 1 μg anti-silei mus monoclonalis anticorporis (TransGen, #HT501-01) in PBS ad totalem reactionem voluminis 50 µl..Reactio mixtura irradiata est cum luce caeruleo DUXERIT pro 0, 2, 5, 10, et 20 min in cella temperie.Mixtura incubata cum 0.1 mM biotin-PEG3-azide (Aladdin, #B122225), 1 mM TCEP, 0.1 mM TBTA ligandi, et 1 mM CuSO4 pro 1 h ad cella temperiei motum sursum movens.Post reactionem disrumpam, 4x Laemmli quiddam directe ad mixturam adde et coque ad 95°C pro 10 min.Exempla in SDS-PAGE nes resolvuntur et per deletionem occidentis cum streptavidin-HRP resolvuntur (1:1000, Solarbio, # SE068).
A histidine-contenta synthetica peptide cum amidation C-terminali (LHDALDAK-CONH2) adhibita est ad resolvendum prope peptide fundatum in vitro labella.In hoc incepto, 100 μM miniSOG purgato, 10 mM probe 3 et 2 μg/ml peptidium syntheticum mixtum est in PBS in totali reactione voluminis 50 μl.Reactio mixtura irradiata est cum caeruleo DUXERIT lux horae 1 in cella temperie.Una microliter exempli analysi utens systematis LC-MS (Aquae, SYNAPT XS IONES Mobilitas Time-of-Fuga massae spectrometri cum programmatibus MassLynx spectri analysis).
HEK293T cellulae miniSOG fusionis generum stabiliter exprimentes in 10 cm patellae pro lineis cum organelle localizationis diversis (Mito, ER, Nucleo) et 15 cm patellae pro lineis Parkin-miniSOG et BRD4-miniSOG.Cum ad ~90% confluentiam pervenisset, cellulae semel cum HBSS ablutae sunt, deinde specillo 3 in HBSS incubatae per horae 1 37°C, et illuminatae cum 10 W caeruleo ad cameram temperatura ducti.Pro non-contactu labella Parkin, 10 µM proton carbonyl cyanidum ferebat m-chlorophenylhydrazonum CCCP (Solarbio, #C6700) probe 3 in HBSS addita est hora 1 37°C.Lysis cellula, preme chymia, reductiones et gradus alkylation eaedem sunt quae supra, excepto quod 2 mg lysati adiecta est et biotin PEG3 azidi adhibitum in pressione reactionis pro azide photodegradabili biotin.Post locupletationem globuli lavabantur 3 vicibus cum 5 ml PBS continentium 0.2% SDS, 3 vicibus cum 5 ml PBS continens 1 M ureas, et 3 vicibus cum 5 ml PBS.Deinceps 2 µg trypsin adiecta est 300 µl 25 mM ABC continens 1 M urea ut inhaereret interdum pernoctare in 37°C.Reactio cessavit addendo acidum formic donec pH 2-3 perventum est.Post trypsinizationem in globulis, solutio peptida dissoluta est utente SOLAµ HRP columna (Thermo, #60209-001) et in vacuo Speedvac concentrato siccatur.Peptides in 0.1% acidum formic et 500 jectarum peptidum resolutae sunt utentes Orbitrapae Fusion Lumos Tribrid massae spectrometri instructi cum fonte nano-ESI descripto.Peptides in precolumnis mercatoriis RP-HPLC separati (75 µm x 2 cm) (Thermo, no. 164946) et analytica RP-HPLC columnae (75 µm x 25 cm) (Thermo, no. 164941), ambo repleti sunt 2 µm.clivus ab 8% ad 35% ACN in 60 minuta, linearly augetur ad 98% B in 6 minutis ad ratem fluens 300 Nl/min.MS spectra (350-1500 m/z) collecta sunt cum resolutione 60,000, AGC 4 105, et maximum initus tempus 50 ms.Electae iones sequenti modo ab HCD in 3 cyclos evulsae sunt cum impetu normalizato 30%, quadrupola solitudo fenestra 1.6 m/z, et resolutio 15000. A 5 × 104 tandem massa spectrometri AGC scopo et tempore maximo iniectio. of, 22 adhibita ms.Exclusio dynamica est 45 secundis. Iones vel illae cum onere 1+ et >7+ reiecti sunt pro MS/MS. Iones vel illae cum onere 1+ et >7+ reiecti sunt pro MS/MS. еназначенные ионы или ионы с зарядом 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Iones vel iones cum onere 1+ et >7+ reiecti sunt pro MS/MS.未指定的离子或电荷为1+ >7+ MS/MS。未指定的离子或电荷为1+ >7+ MS/MS。 еуказанные ионы или ионы с зарядами 1+ и >7+ были отклонены для МС/МС. Non specificatae iones vel iones cum criminibus 1+ et >7+ reiecti sunt pro MS/MS.
Praeparatio specimen specimen ad grana NeutrAvidin amplificanda eaedem fuerunt ac in analysi LC-MS/MS de quibus supra.Proxime 50 µg lysatae adhibitum est ut initus ad onerandas imperium et 2 mg lysati adhibitum ad motus cliccum.Post locupletationem et lavationem neutravidinam, ligaturae servo eluuntur addendo 50 µl ex Laemmli quiddam ad agarosam globuli resinae et decoctionis 95° C. per 5 minuta.Imperium oneris initus et capita aucta exemplaria a SDS-PAGE enucleata sunt et ad membranas PVDF (Millipore, #ISEQ00010) translatae sunt per modum notae occidentis notae.Membranae praeclusae sunt cum 5% lactis ski (Sangon, #A600669) in TBS continentibus 0,1% inter 20 (TBST) et sequenti modo cum elementis primis et secundariis incubatis.Primaria elementorum corpora diluta 1:1000 in 5% lac in TBST hauriuntur et pernoctare in 4°C incubantur.Secundaria elementorum in ratione 1:5000 adhibita sunt et incubata pro 1 hora in cella temperie.Membranae chemiluminacentiae subjiciuntur utentes systemati chemico MP imaginandi.Omnes incisae scans deletionum et nes in figura sistuntur notitiae rudis.
Primaria elementorum usus in hoc studio lepus anti-SFPQ anticorpus monoclonale comprehenditur (CST, n. 71992), lepus anti- FUS anticorpus monoclonalis (CST, n. 67840), lepus anti-NSUN2 anticorpus polyclonale (Proteintech, n. 20854-1- Lepus anti-mSin3A anticorpus polyclonal (Abcam, #ab3479), mus anti-tag anticorpus monoclonal (TransGen, # HT201-02), mus anti-β-actin anticorpus monoclonal (TransGen, # HC201-01), lepus anti -CDK2 anticorpus monoclonal (ABclonal, #A0094), lepus anticorpus monoclonalis ad CTBP1 (ABclonal, #A11600), lepus polyclonalis anticorpus DUT (ABclonal, #A2901), lepus anticorpus polyclonalis ad PSMC4 (ABclonal, #A2505), lepus anti- DNAJB1 anticorpus polyclonale (ABclonal, #A5504).Haec elementorum 1 1000 mixtio in 5% lactis in TBST adhibita est.Secundae elementorum in hoc studio adhibitae anti-lepus IgG (TransGen, #HS101-01), anti-mus IgG (TransGen, #HS201-01) ad 1:5000 dilutionem.
Ad ulterius investigandum num BRD4 cum SFPQ, firmum HEK293T et BRD4-miniSOG, cellulae HEK293T superexpressae patellae in 10 cm patellae sint.Cellae frigidae PBS ablutae sunt et lysed in 1 ml Pierce IP Lysis quiddam (Thermo Fisher, #87787) cum EDTA-liberi inhibitoris protease per 30 minuta in 4°C.Postea lysatae collectae sunt in tubis centrifugii 1.5 ml, et centrifugi ad 15,871 xg pro 10 min ad 4°C.Supernatant messa et incubata 5 µg anti-V5 muris monoclonalis anticorporis intitulatum (CST, #80076) pernoctare in 4°C.Lava circiter 50 µl globuli magnetici A/G (MCE, #HY-K0202) bis cum PBS continentibus 0.5% Inter-20.Tum cellae lysatae globulis magneticis incubuerunt per 4 horas ad 4°C cum rotatione ab imo ad summum.Grana deinde quater abluta cum 1 ml PBST quiddam et decoctum 95°C pro 5 min.Exemplaria in nes SDS-Paginae resolvuntur et ad PVDF membranas transpositae methodi notae Occidentis notae sunt.Membranae clausae sunt in 5% lactis in TBST scapulae, et incubatis continue cum elementis primariis et secundariis.Primarius Anticorpus Lepus anti-SFPQ anticorpus monoclonale (CST, #71992) adhibita est ratione 1: 1000 in 5% lactis in TBST hauritur et incubatur pernoctare in 4°C.Anti-lepus Igg adhibebatur ad rationem 1:5000 et incubatis pro 1 hora ad cella temperie.Membranae chemiluminacentiae subjiciuntur utentes systemati chemico MP imaginandi.
Omnes structurae pro Area Superficie Solventi Accessibili adhibitae (SASA) analysi e interdum Data Bank (PDB)52 vel AlphaFold Dapibus Structura Database53 impetrata sunt.SASA absolutum computavit pro singulis residuis programmatis FreeSASA utendi.Solummodo integra et indubitata SASA notitia pro histidine intitulata et finitimi eius ad medium SASA pro unaquaque structura obtinendum adhibita sunt.Relativum solvendo accessibilitas (RSA) pro singulis histidine computata est dividendo valorem absolutum SASA per maximum empiricum residuum superficiei areae quae solvendo praesto est.Omnes histidines tunc erant occultae si medium RSA infra 20% erat, alioquin expositum.
Rudis lima in DDA modum consecuta quaesita sunt utens Proteome Inventor (v2.5) vel MSfragger (Fragpipe v15.0) in opportunitate SwissProt verificata interdum database continet communes contaminantes.Peptides trypsin integram requirunt cum duabus sitibus bifidorum absentis, methylationis carbamoyl ut modificationis certae et oxidationis methioninae sicut modificationis dynamicae.Praecursor et fragmentum tolerantiae pondus 10 ppm et 0.02 Da (MS2 Orbitrap), respective. Contaminantes hits sublati sunt, et servo eliquata sunt ad ratem inveniendam falsam <1%. Contaminantes hits sublati sunt, et servo eliquata sunt ad ratem inveniendam falsam <1%. опадания загрязняющих веществ ли ​​удалены, а белки отфильтрованы, чтобы получить коэффициения ложного отфильтрованы, чтобы получить коэффициения ложного отфильтрованы, чтобы получить коэффициения ложного отфильтрованы Contaminantes hits sublati sunt et servo percolantur ut ratam <1% deprehensionem falsam redderent.<1%的错误发现率。 <1%的错误发现率。 опадания загрязняющих веществ ли ​​удалены, а белки отфильтрованы для достижения уровня ложных обнаружени1%. Contaminantes hits sublati sunt et servo percolantur ad ratam falsam positivi <1% consequendam.Pro analysi quantitatis sine usu pittaculorum, normalizata interdum contenta e tribus repetitis biologicis adhibita erat.Dapibus subcellularis localisation analysin fiebat usus Gene Ontologiae (GO) analysis ex DAVID Bioinformatics Resources, MitoCarta 3.0 et databases compilata et publicata ab Alicie Ting caterva.Volcano tabula a Perseo impetrata (v1.6.15.0). Dapibus abun- dantiae mutationes probatae sunt propter significationem statisticam utentes bipertitum t-test, et dapibus hits cum abundantia mutationis >2 (nisi aliter dictum est) et p valorem <0.05. Dapibus abun- dantiae mutationes probatae sunt propter significationem statisticam utentes bipertitum t-test, et dapibus hits cum abundantia mutationis >2 (nisi aliter dictum est) et p valorem <0.05. Изменения кратности содержания белка были проверены на статистическую значимость с использованием двустороннего t-критерия, и совпадения белков были идентифицированы с изменением содержания> 2 (если не указано иное) и значением p <0,05. Dapibus contenti plica mutationes probatae sunt pro significatu statistica utens bilinguis t-test, et intermedia compositus cum contenta mutatione >2 (nisi aliter notatur) et ap valor <0.05.t > 2（除非另有说明）和p <0.05。T P Статистическую значимость кратных изменений содержания белка проверяли с использованием двустороннего t-критерия, а совпадения белков определяли для изменений содержания >2 (если не указано иное) и p-значений <0,05. Significatio statistica plicarum mutationum in interdum contentis probata est utens bilinguis t-test, et intermedia compositus pro contentis mutationibus >2 (nisi aliter indicatum est) et p-valores <0.05.Analysis commercium interdum fiebat utens GO analysis una cum Filo datorum.
Tres replicationes biologicae cum similibus eventibus factae sunt.Analysis statistica facta est cum GraphPad Prismo (in programmate GraphPad) et machinae vulcani cum Perseo generatae sunt (v1.6.15.0).Ad duos circulos comparare, p-valores duo caudati Discipulus test.Solum unum proteins quae bis saltem in circulo experimentali in insidiis volcani erant comprehendebantur, et valores absentes in coetus regendi substituti sunt cum Perseo ex distributione normali ita ut p-valor iniri posset.Claustra erroris medium deviationis vexillum significant.In analysibus proteomicis pro analysi statistica, copia servo- rum quae apparuerunt in duobus saltem replicationibus biologicis retenta est.Rationes statisticae non adhibebantur ad magnitudinem exempli praeiudicandam.Experimenta non temere sunt.Investigatores in experimentis et perpensis eventuum pensa non fuerunt caeca.
Pro maiori investigatione de consilio, naturam Research Report abstractam cum hoc articulo coniunctam videre.
Massa spectrometriae data in hoc studio latum est ad ProteomeXchange Consortium per iProX57 socium repositorium sub dataset ID PXD034811 (PDPL-MS dataset).Rudis notitia in forma lima notitia rudis sunt.Hic articulus praebet notitia originalis.
Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ut cognoscas vicinitatem: cum biotinyla propinquitas dependens ad dapibus complexiones et organellas describendas. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. ut cognoscas vicinitatem: cum biotinyla propinquitas dependens ad dapibus complexiones et organellas describendas.Gingras, AS, Abe, KT et Raut, B. Familiaritas cum circumstantibus: cum biotinyla propinquitate-dependentia utentes complexiones interdum denotant et organellas geographicas. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Gingras, AC, Abe, KT & Raught, B. Intellectus vicinitatis: uti dependentia viciniae a vita biologica.Gingras, AS, Abe, KT et Raut, B. Intellectus proximitatem: characterizationem complexorum interdum et organelles destinata utentes biotinylationis propinquitatis-dependens.Vena.Meam sententiam.Chemical.biologia 48, 44-54 (2019).
Geri, JB et al.Mapping microenvironmenta transferendo Dextera energiam ad cellulas immunes.Scientia 367, 1091-1097 (2020).
Hertling, EL et al.Duo-proteome scalae retiaculis cellularum specialium interactomi humani retexere deprehendunt.Cellulae 184, 3022-3040.e3028 (2021).